Proteinkomplexe in Eukaryonten und Prokaryonten: Ein Experiment

Ich trage diese Idee schon eine ganze Weile mit mir herum. In absehbarer Zeit komme ich selbst kaum dazu, direkt daran zu arbeiten, außerdem fehlt mir zum Teil das Know-how. Was liegt näher, als hier im Blog um Hilfe zu bitten?

Es ist ein Experiment. Es geht um ein kleines Forschungsprojekt, dass ich hier vorstellen möchte. Im wahrscheinlichsten Fall (es interessiert keinen) werden nur ein, zwei Blogposts draus, die einen kleinen Einblick in mein Forschungsgebiet geben.
Im bestmöglichen Fall finden sich hier ein paar Biologen, Biochemiker, Biophysiker oder Physiker oder Mathematiker mit Interesse an biologischen Fragestellungen, wir kriegen tatsächlich ein paar Ergebnisse und versuchen diese dann zu publizieren. Nicht im Blog, sondern als Paper.
Grob gesprochen kommen Zellen in zweierlei Größen vor. Sie sind entweder rund einen Mikrometer groß, dazu zählen die meisten Prokaryonten, wie zum Beispiel E. coli, oder sie sind rund 10 Mikrometer groß, dazu zählen eukaryontische Zellen, wie zum Beispiel die der HeLa Tumorzelllinie. Das Volumen dieser Zellen unterscheidet sich also deutlich. Die einen haben etwa 1 µm³ Volumen, die anderen etwa 1000 µm³.
Für meine Idee müssen wir uns anschauen, wie es in der Zelle aussieht, und was dort eigentlich passiert. Das Innere einer Zelle ist ziemlich voll (Abbildung 1). Das meiste sind Proteine, die dort dicht an dicht gedrängt, aber dennoch gelöst vorliegen. Diese Moleküle liegen keinesfalls nur still da, sie bewegen sich durch die Brownsche Molekularbewegung ständig.

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Abbildung1: Macromolecular Crowding in einer eukaryontischen Zelle.

Die Proteine in der Zelle zittern und diffundieren auch nicht nur einfach so vor sich hin, sie haben eine Funktion. Manche bilden filamentöse Strukturen, das Zytoskelett. Andere katalysieren chemische Reaktionen, und wieder andere lösen komplexe zelluläre Aufgaben, wie die Transkription von Genen oder die Translation von RNA Segmenten in Aminosäureketten (die sich wiederum zu neuen Proteinen falten). Viele dieser Aufgaben werden nicht von einzelnen Proteinmolekülen durchgeführt, sondern von sogenannten Proteinkomplexen, also mehrere Proteine im Verbund.
Bei meiner Idee geht es um die Proteinkomplexe und wie deren Komponenten zueinander finden.
Angenommen drei Proteine A, B und C bilden einen Komplex und sie liegen jeweils als 100 Moleküle pro Zelle vor, dann erscheint es logisch, dass sich diese drei Proteine in der kleineren Zelle viel schneller finden als in der großen. Hier also die erste Frage: Wie viele Moleküle müssten in der großen Zelle von A, B und C vorhanden sein, um in der gleichen Zeit genausoviele Komplexe wie in der kleinen Zelle zu bilden?
Es wird noch komplizierter. Proteine haben unterschiedliche Bindungsaffinitäten. Manche binden stärker, andere weniger stark an ihre Partner. Wie müssten sich diese Bindungsaffinitäten unterscheiden, dass in der größeren Zelle bei gleicher Anzahl von Proteinen A, B und C gleich viele Komplexe entstehen?
Große (eukaryontische) Zellen haben verschieden Strategien entwickelt, um diesem Problem zu entgehen. Zum einen sind eukaryontische Zellen kompatimentalisiert. Es gibt also verschieden Regionen in der Zelle, in denen die lokale Konzentration einzelner Proteine höher ist. Es gibt zum Beispiel den Zellkern oder Vesikel. Zum anderen haben eukaryontische Zellen spezifische Sortierungs-und Transportmechanismen für einzelne Proteine, um sicher zu gehen, dass diese auch dort in der Zelle hinkommen, wo sie sollen.

Hier also die Hypothese:
Ich glaube nicht, dass die Kompartimentalisierung oder der gerichtete Transport ausreicht, um zu garantieren, dass sich Proteinkomplexe in eukaryontischen Zellen effektiv bilden, besonders nicht im Zytosol und in der Zellmembran. Ich glaube auch nicht, dass die eukaryontischen Zellen durch die reine Erhöhung der Anzahl der einzelnen Proteine sicher stellt, dass sich Proteinkomplexe effektiv bilden. Ich denke, die Affinitäten der einzelnen komplexbildenden Proteine zueinander sind in eukaryontischen Zellen höher als in prokaryontischen Zellen.
Während also in E. coli möglicherweise ein “Just-in-time Assembly” der Komplexe stattfindet, bedingt durch einfache Diffusion und durch schwächere Interaktionen zwischen den komplexbildenden Proteinen, sind in höhreren Zellen stabile Proteinkomplexe ein häufigeres Phänomen. Dadurch kann die Zahl der einzelnen Proteine geringer gehalten werden und die Regulation durch die Genexpression wirkt direkter.
So. Um das ganze anzugehen brauchen wir als erstes jemanden, der Protein-Protein Interaktionen mathematisch auf Basis der Diffusion in Zellen modellieren kann. Dabei muss die Zellgröße, die Bindeaffinitäten der Proteine und Effekte des Macromolecular Crowding berücksichtigt werden. Jemand muss in der Literatur und in Datenbanken nach Bindeaffinitäten von Proteinen in Komplexen suchen. Wenn die Diffusion in der Zelle nicht zeitlich limitierend ist, ist das Projekt tot.
Der nächste Schritt wäre, experimentell zu zeigen, dass sich zwischen Prokaryonten und Eukaryonten konservierte Komplexe mit unterschiedlichen Affinitäten bilden. Entweder klassisch in vitro mit gereinigten Komponenten und Aktivitätsassays oder mit FRET, vielleicht light scattering, oder anderen Methoden, die Aufschluss über die Komposition der Komplexe geben. In vivo wäre natürlich die Krönung, nur wie?
Jemand Interesse? Sonst bleibt es eben eine Idee und ein Blogpost über einen kleinen Ausschnitt meiner Arbeit.

Abbildung 1 aus diesem Open-Access Paper:
ResearchBlogging.orgMinton, A. (2001). The Influence of Macromolecular Crowding and Macromolecular Confinement on Biochemical Reactions in Physiological Media Journal of Biological Chemistry, 276 (14), 10577-10580 DOI: 10.1074/jbc.R100005200
Das hier könnte auch helfen:
ResearchBlogging.orgBeyer, A. (2004). Dynamic simulation of protein complex formation on a genomic scale Bioinformatics, 21 (8), 1610-1616 DOI: 10.1093/bioinformatics/bti223

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13 Kommentare

  1. Ich verstehe kein Wort von der Fragestellung, finde den Ansatz aber lobenswert und bin gespannt, wie es weitergeht. Wenn ich die mir bekannten Blogs von Wissenschaftler/innen Revue passieren lassen (mich eingeschlossen :-), dann fallen mir nur sehr wenige ein, die aus ihrer Blogtätigkeit unmittelbar für ihre eigene Arbeit einen Nutzen (Kollaboration mit vorher unbekannten Kollegen, Korrekturen oder Verbesserung der eigenen Arbeit, etc. ) ziehen konnte. Ausgeschlossen natürlich die Web2.0-Leute (Mediensoziologen, -pädagogen), die mit dem Medium unmittelbar etwas anfangen können. Vielleicht sollte ich mal etwas dazu schreiben… vermutlich aber eher gegen Ende der Woche.

  2. Hast du mal überlegt, welche Größenordnung der Effekt haben müsste, wenn er denn existiert? Ich denke eine grobe Schätzung auf der Basis geometrischer und physikalischer Eigenschaften sollte auch ohne mathematisches Modell möglich sein.
    Die Aufgabe ist m.E. ziemlich analog zur Reaktionsrate in der Chemie, abhängig von Konzentration, Aktivierungsenthalpie etcetera, etcetera. Ich denke das wäre ein guter Ansatz.

  3. “Der nächste Schritt wäre, experimentell zu zeigen, dass sich zwischen Prokaryonten und Eukaryonten konservierte Komplexe mit unterschiedlichen Affinitäten bilden.”
    Heisst der Begriff “konservierter Komplex” dass du einen Modellproteinkomplex suchst, welcher sowohl in Prokaryonten als auch in Eukaryonten vorkommt, aber in Eukaryonten leicht angepasste Proteinstrukturen der Untereinheiten aufweist, um den Nachteil des größeren Zellvolumens auszugleichen?
    Welche Komplexe kämen denn dafür in Frage?

  4. Ja, stimmt, Eva. So gehts auch.
    Dazu bräuchte man die Strukturen der Komplexe (und nicht nur der Einzelproteine) oder müsste irgendwie anders sagen können, wo die Proteine aneinander binden.
    Ausserdem müsste man für die Kandidaten wissen, wie genau sich Mutationen auf die Bindeaffinitäten auswirken.
    Vielleicht reicht es auch erst mal klassische Protein-Protein Bindedomänen zu untersuchen und zwischen Bakterien und Eukaryonten vergleichen. Vielleicht wurde das auch schon gemacht. Hier mal eine Auswahl von Proteininteraktionsdomänen.

  5. Das ist so gar nicht mein Fachgebiet, aber so ein nettes interaktives Projekt, da gebe ich doch gern meinen Senf dazu 😉
    was Markus da zitierte, fiel mir auch als Ansatzpunkt auf – wenn Deine Hypothese stimmt, dann müssen sich konservierte Proteinkomplexe an ihren Bindungsstellen deutlich geändert haben, und das müsste sich doch über Proteindatenbanken verifizieren lassen? Und das kann man doch am besten testen, wenn man schon mal Kandidaten für solche Proteine hat; also konservierte Proteine, die ohne Signalsequenz im Cytosol (und nicht im ER) synthetisiert werden. Deswegen würde ich mit dem Schritt beginnen und mit den Treffern dann die mathematischen Modelle erstellen ?

  6. Hey Tobi, ich kann dir zwar nicht direkt helfen, aber vielleicht bringt dich dieses Paper irgendwie weiter, über das ich mal geschrieben habe: Es geht um eine Methode namens “Translation site imaging” mit der man Proteine am Translationsort direkt nachweisen kann. Häuft sich also die mRNA irgendwo in einer Stelle in der Zelle an, damit dort eine spezifische Proteinkonzentration entsteht, so ist dies direkt nachweisbar. Verantwortlich für solche Anhäufung von Proteinen sind sogenannte Zipcode-Sequenzen. Das Protein polymerisiert dann erst ab einer bestimmten Konzentration.

  7. Hallo Tobias,
    bin selbst Postdoc und Enzmymologe. Zur ersten Frage: weshalb müssen die Komplexe sich alle in der gleichen Zeit zusammenfinden, die Teilungsrate von E.coli liegt bei 20-30 min, bei der Hefe deutlich höher und humane Zellen benötigen nochmals länger. Klar spielen Replikation des Genoms, Prozessierung der eukaryontischen mRNA, etc. eine Rolle für die Zellteilung. Doch alleine beim simplen Experiment der Expression eines Protein in z.B. E. coli wird 3-4 Stunden nach der Induktion geerntet, hingegen bei der mammalian Zellkultur 2-3 Tage nach der Transfektion.
    Lange Rede kurzer Sinn, vielleicht benötigen größere Zellen für die meisten Prozesse eine längere Zeit, z.B. auch für die Ausbildung eines Proteinkomplexes.

  8. Mark,
    auch schön, danke.
    Ich glaube allerdings nicht, dass die Dynamik von Proteinkomplexen der limitierende Faktor bei der Zellteilung ist, eher, wie du schon sagst (bei sich schnell replizierenden Organismen im Labor) die Replikation des Genoms. Wahrscheinlich auch irgendwo die Anzahl der Ribosomen.
    Ich denke, E. coli kann schon nach ein paar Stunden geerntet werden, da es durch starke Promotoren in kurzer Zeit viel Protein synthetisieren kann.
    Die gute! Idee von paco war übrigens FCCS zu verwenden, um in vivo die Dynamik von Proteinkomplexen zu studieren.
    Von paco kommt auch die Zahl, dass in Zellen Diffusion rund 3 Mal langsamer Stattfindet als in wässriger Lösung (im Kern bis zu 5 Mal langsamer).

  9. Eine klasse Idee, Mitstreiter für ein Forschungsprojekt über das Blog zu suchen. Von der Fragestellung habe ich leider kaum die Hälfte verstanden und könnte daher maximal mit statistischen Berechnungen aushelfen, die ja aber auch jeder Biologe im Schlaf beherrschen dürfte. Fände es trotzdem spannend, wenn Du darüber berichten würdest, wie sich die Suche nach Mitstreitern weiter entwickelt…

  10. Nicht denken, sondern rechnen ! Ich meine, so eine Frage wird nur durch einen mathematsichen Ansatz gelöst. Davon reden und schreiben hängt von Intuition ab, lässt es uns deswegen nur auf irgendwelchem Weg irren.
    Tschüss

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